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（点击下载）水质总大肠菌群、粪大肠菌群和 大肠埃希氏菌的测定酶底物法 |
前言
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。
本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位：上海市环境监测中心。
本标准验证单位江苏省环境监测中心、浙江省环境监测中心、常州市环境监测中心、上海市松江区环境监测站、上海市长宁区环境监测站和上海市青浦区环境监测站。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法
1 适用范围
本标准规定了测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的酶底物法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定。本方法的检出限为10 MPN/L。
2 规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验用水规格和实验方法
GB/T 14581 水质湖泊和水库采样技术指导
HJ 494 水质采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
总大肠菌群total coliforms
37℃培养24 h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
3.2
粪大肠菌群fecal coliforms又称耐热大肠菌群（thermotolerant coliforms）。44.5℃培养24 h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。
3.3
大肠埃希氏菌Escherichia coli俗称大肠杆菌。37℃培养24 h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚，同时产生β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase），分解选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放出荧光物质（4-甲基伞形酮）的肠杆菌科细菌。
3.4
最大可能数most probable number（MPN）又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。
4 方法原理
在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生β-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP）；大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现数量，查MPN 表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。
5 干扰和消除
5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入硫代硫酸钠溶液（6.4）消除干扰。
5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5）消除干扰。
6 试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水应满足GB/T 6682中三级水的要求。
6.1 培养基。
本标准采用Minimal Medium ONPG-MUG 培养基。每100 ml 样品需使用培养基粉末。
2.7 g±0.5 g，所含基本成分如下：
硫酸铵[(NH4)2SO4] 0.5 g
硫酸锰（MnSO4） 0.05 mg
硫酸锌（ZnSO4） 0.05 mg
硫酸镁（MgSO4） 10 mg
氯化钠（NaCl） 1 g
氯化钙（CaCl2） 5 mg
亚硫酸钠（Na2SO3） 4 mg
两性霉素B（Amphotericin B） 0.1 mg
邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG） 50 mg
4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG） 7.5 mg
茄属植物萃取物（Solanium 萃取物） 50 mg
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸钠盐（HEPES 钠盐） 0.53 g
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES） 0.69 g
也可采用市售商品化培养基制品。
6.2 硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）。
6.3 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
6.4 硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/ml。称取15.7 g 硫代硫酸钠（6.2），溶于适量水中，定容至100 ml，临用现配。
6.5 乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15 g/ml。称取15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.3），溶于适量水中，定容至100 ml，此溶液保质期为30 d。
6.6 97 孔定量盘：含49 个大孔，48 个小孔。其中，每个小孔可容纳0.186 ml 样品，大孔中48 个大孔每个可容纳1.86 ml 样品，一个顶部大孔可容纳11 ml 样品。也可采用经环氧乙烷灭菌的市售商品化成品。
6.7 标准阳性比色盘。
6.8 无菌水：取适量实验用水，经121℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。
7 仪器和设备
7.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的100 ml、250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。
7.2 高压蒸汽灭菌器：121℃可调。
7.3 恒温培养箱：允许温度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
7.4 程控定量封口机：用于97 孔定量盘（6.6）的封口。
7.5 紫外灯：365～366 nm。
7.6 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用计量合格的可调式移液器。
7.7 三角瓶：100 ml。
7.8 量筒：100 ml±1 ml。
7.9 一般实验室常用仪器和设备。
注：三角瓶、移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具要在试验前按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸
汽灭菌20 min，烘干，备用。
8 样品
8.1 样品采集
点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ/T 494 和HJ/T 91 的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面10～15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水3～5 min，然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3 min 灭菌或用70%～75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.4），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125 ml 容积加入0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.5），以消除干扰（每125 ml 容积加入0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.2）可去除样品中1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯
量调整。
8.2 样品保存
采样后应在2 h 内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2 h 内检测。
9 分析步骤
9.1 样品稀释
根据样品污染程度确定接种量（见表1），避免接种样品培养后97 孔定量盘（6.6）出现全部阳性或全部阴性。接种量小于100 ml 时，应稀释样品后接种，接种量为10 ml 时，取10 ml 样品加入到盛有90 ml 无菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混匀制成1:10 的稀释样品，其他接种量的稀释样品依次类推。对于未知样品，可选用多个接种量进行检测。
9.2 接种
量取100 ml 样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶，加入2.7 g±0.5 g 培养基（6.1）粉末，充分混匀，完全溶解后，全部倒入97 孔定量盘（6.6）内，以手抚平97 孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用程控定量封口机（7.4封口。观察97 孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘（6.7）的颜色，则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后，终止试验或重新操作
注：9.1、9.2 步骤在野外操作时应避开明显局部污染源，建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。
9.3 培养
测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，将封口后的97 孔定量盘放入恒温培养箱（7.3）中37℃±1℃下培养24 h。测定粪大肠菌群时，将封口后的97 孔定量盘放入的恒温培养箱中44.5℃±0.5℃下培养24 h。
9.4 对照试验
9.4.1 空白对照
每次试验都要用无菌水（6.8）按照步骤9.1～9.3 进行实验室空白测定。培养后的97 孔定量盘不得有任何颜色反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。
9.4.2 阴性和阳性对照
总大肠菌群、大肠埃希氏菌、粪大肠菌群的阴性、阳性菌株参考表2。
表2 阴性、阳性菌株参考表
| 检测指标 | 阳性菌种 | 阴性菌种 |
| 总大肠菌群 |
大肠埃希氏菌、 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes） |
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、 假单胞菌属（Pseudomonas sp.） |
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大肠埃希氏 菌 |
大肠埃希氏菌 |
金黄色葡萄球菌、 假单胞菌属 |
| 粪大肠菌群 |
大肠埃希氏菌（耐热型）、 克雷伯氏菌属（Klebsiella trevisan） （耐热型） |
产气肠杆菌、 粪链球菌（Streptococcus faecalis）、 假单胞菌属 |
将标准菌株制成300～3000 个/ml 的菌悬液，将菌悬液按接种（9.2）和培养（9.3）要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测定。
注：可先制备较高浓度菌悬液，采用血球计数器在显微镜下对其浓度进行初步测定，然后根据实际情
况用无菌水（6.8）稀释至300～3000 个/ml。
9.4.3 结果判读与计数
将培养24 h 后的97 孔定量盘进行结果判读，样品变黄色判断为总大肠菌群或粪大肠菌群阳性；样品变黄色且在紫外灯（7.5）照射下有蓝色荧光，判断为大肠埃希氏菌阳性。如果结果可疑，可延长培养至28 h 进行结果判读，超过28 h 后出现的颜色反应不作为阳性结果。可使用保质期内的标准阳性比色盘以辅助判读，参见附录A。分别记录97 孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。